Russian Federation
The materials and methods of pharmacological and toxicological study of indole derivatives are presented. The choice of experimental biological models for the experiment is justified
indole, 3-chloroacetylindole, 3-methylaminoacetylindole
Учитывая возможности использования соединений индола в различных областях жизнедеятельности человека, возникает необходимость их изучения с целью оценки потенциальной и реальной опасности при ингаляционном, пероральном и местном применении. Многовековые наблюдения за эффектами растительных индолов позволили накопить обширный, в том числе и клинический материал, и в целом, получить общее представление об основных проявлениях побочного и токсического действия каждого из представителей ряда индолов на организм. Вместе с тем, фармакологическая индустриализация привела к появлению десятков, если не сотен, полусинтетических и синтетических препаратов, инструктивно требующих детального фармакологического и токсикологического изучения. Поэтому на первый план выходит экспериментальное направление, привлекательное возможностью выделения монофактора в картине ответной реакции организма животного на воздействие. Однако, возникает целый ряд проблем, прежде всего, этического порядка, сопровождающихся обязательностью соблюдения отечественных нормативно-правовых документов:
- «Правила проведения работ с использованием экспериментальных животных» (приложение к Приказу Минздрава СССР № 755 от 12.08.1977г.);
- «Правила лабораторной практики» (приложение к Приказу Минздрава РФ № 708 Н от 23.08.2010 г.).
Следует принимать к сведению и существующие зарубежные требования к использованию лабораторных животных, включая Хельсинскую декларацию Всемирной медицинской ассоциации 1964 года (с изменениями 1975, 1983 и 1989 гг.). Решительный тон защитников животных, несомненно, положительно звучит с этической точки зрения, но на практике доказательной медицины следует исходить из соображений социокультурной целесообразности во благо человека. Активное движение в защиту животных не снизило поголовья лабораторных животных в вивариях научно-исследовательских учреждений медицинского и биологического профиля, более того, появляются новые линии животных, расширяющие возможности моделирования патологических состояний, близких к человеку, что приводит к развитию многих направлений медицинской науки без существенного ущерба для биоэтических норм. Но при этом возникает и еще одна существенная проблема – это выбор вида животных для эксперимента.
Виварии крупных научно-исследовательских учреждений соответствующего профиля, как правило, располагают большим выбором видов лабораторных животных, пригодных для достижения столь же большого набора целей эксперимента. Например, виварий – НИИ биофизики АнГТУ, сертифицированный (вет. удостоверение 238 № 0018304), располагал возможностью комфортного размещения более 10000 голов от мышей до крупных сельскохозяйственных животных разных линий и кроме этого – террариумами для водных животных, а также микробиологической лабораторией, позволяющей работать с культурами тканей.
Чаще всего в мировой практике в качестве экспериментально-биологической модели используются нелинейные крысы (для целей гигиенического исследования) и линии Вистар (для фармакологического исследования). Крысы – это достаточно доступная и адекватная модель, которая размещается на сравнительно небольшой территории, обладает небольшой массой тела и достаточно устойчивая к инфекционным заболеваниям, имеет большой и частый приплод, популяционно-гетерогенная, легко фиксируются рукой человека. Постоянная наполненность желудка крыс позволяет вводить им необходимые для исследования растворы и взвеси без риска повреждения слизистой. У крыс хорошо выражено сходство с организмом человека в основных показателях состояния обмена веществ. В экспериментах предпочтение отдается крысам-самцам (если нет специальных указаний) с их менее отчетливыми гормональными колебаниями. Однако имеются и некоторые особенности, которые ограничивают их использование. На крысах не исследуют функции желудочно-кишечного тракта, поскольку у них отсутствует желчный пузырь. Они мало пригодны для оценки гемостазиологических процессов, особенно тромбообразования, но это ограничение иногда оказываются преодолимым [1, 3, 4]. Мыши чаще всего используются для оценки общих и немедленных реакций на воздействие, а также для выявления доминантных летальных мутаций. Крысы и мыши удобны для исследования местного и кожно-резорбтивного действия по хвостовой методике, для оценки функционирования центральной и периферической нервной системы.
Хомяки более пригодны для целей экспериментальной онкологии. Морские свинки, в большинстве случаев, используются для выявления эффектов сенсибилизации. Кролики удобны в условиях изучения сердечно сосудистой системы, местного раздражающего действия на слизистые и для моделирования ожоговой болезни. Во многих случаях рекомендуется использовать собак породы Бигль. Однако в России эта порода мало распространена, в необходимых количествах ее нет и в питомниках.
Нами, в условиях фармакологических исследований ограниченно использовалась выродившаяся порода собак - эрдельтерьер с малой массой тела. В данном случае необходимо сделать уточнение, у собак невыраженные процессы ацетилирования, что делает их непригодными для изучения некоторых лекарств и промышленных химических веществ, трансформация которых в организме происходит именно через процессы ацетилирования [8]. Рыбы и другие водные организмы пригодны для целей коммунальной токсикологии и экотоксикологии.
Этот краткий экскурс в область экспериментально-биологического моделирования необходим в силу того, что индол и его соединения в той или иной мере могут затрагивать любую из функционирующих систем организма, и для объективизации этих процессов, необходимо использовать разные виды животных с оценкой состояния их организма по множеству интегральных и частных (специфических) показателей.
В токсикологическом исследовании 3-хлорацетилиндол и 3-метиламиноацетилиндолнами были использованы линейные (нелинейные) крысы (возраст–2,5-3 месяца, масса–150-160г) и мыши (возраст –2-2,5 месяца, масса–18-20г.), кролики серой масти и морские свинки собственного разведения (самцы и самки). Животные распределялись по группам (6-10 особей) с учетом массы тела и пола. Каждому отобранному животному был присвоен индивидуальный номер, как и группе, обозначенный пикриновым красителем.
Родоначальная популяция крыс и мышей поступила из племенного хозяйства Государственного научного центра вирусологии и биотехнологии ФС по надзору в сфере защиты прав потребителей и благополучия человека «Вектор» (г. Новосибирск). Критерием включения животных в эксперимент являлось ветеринарное заключение местной службы Госветнадзора, а также заключение Областной ветеринарной лаборатории на бактерионосительство, отсутствие видимых проявлений заболеваний, однородность по массе тела (различия по массе тела в группах не более 10%) и, в ряде случаев, по анализу периферической крови и некоторым другим показателям. Тест-системы использовали типовые, принятые в экспериментальной токсикологии и фармакологии для данных условий воздействия [5, 6, 7, 9].
Животные содержались в стандартных условиях в соответствии с правилами, утвержденными МЗ СССР 06.07.73г., об устройстве, оборудовании и содержании экспериментально–биологических клиник (вивария):
- температура в помещениях – 18-21оС;
- влажность воздуха – 60-70%;
- воздухообмен – 12-15 объемов помещения/час с фильтрацией приточного воздуха;
- содержание СО2 в воздухе – 0,12 объемных %;
- содержание аммиака в воздухе – не более 1 мг/м3.
Световой режим составлял: 12 часов – свет, 12 часов – темнота.
Крысы и мыши содержались в пластиковых клетках.
Клетки использовались:
- для крыс – пластиковые со съемной металлической решетчатой крышкой и встроенными устройствами для размещения корма и емкости с водой, размером 60х35х20 см;
- для мышей – пластиковые со съемной металлической решетчатой крышкой и встроенными устройствами для размещения корма и емкости с водой, размером 43х28х16 см;
для кроликов – металлические пластинчатые клетки, размером 70х50х50 см.
На клетку подвешиваются емкости для корма и воды. Подстил для мышей, крыс и морских свинок выполнен из древесной стружки.
Кролики и морские свинки содержались в отдельных металлических клетках по одному. Для кроликов и морских свинок подстил не предусмотрен, только металлическая мелкоячеистая решетка. Кормление животных осуществлялось в соответствии с приказом №755 Минздрава СССР от 12.08.77г.
Животным давалась вода, соответствующая ГОСТу 2874–82 «Вода питьевая» в необходимом количестве. Животные до начала исследований содержались 14 дней для адаптации в помещениях и клетках, предназначенных для подопытных групп. В течение этого периода проводился визуальный осмотр животных для выбраковки особей с отклонениями в общем состоянии и поведении.
Показатели для оценки состояния организма животных в эксперименте были выбраны в соответствие данным источников информации о характере токсического действия того или иного препарата и требованиям официальных методических руководств. Исследования были проведены в соответствии с нормативной документацией [7, 10, 11, 12, 13].
В качестве показателей состояния организма животных в исследовании были выбраны:
1. Физиологические показатели:
- масса тела (определялась у крыс еженедельно),
- потребление воды крысами определялось ежедневно,
- офтальмологическое исследование было ограничено оценкой состояния слизистых глаза и роговичным рефлексом,
- нагрузочная проба с гексеналом,
- исследовательский (норковый) рефлекс у крыс на открытом поле,
- спонтанная двигательная активность при ее автоматической регистрации у крыс;
- суммационно-подпороговый показатель у крыс с использованием электростимулятора ЭС-50-1 в модификации В.Д. Бартенёва,
- электрокардиография во II ст. отведении, ЧСС у крыс с использованием электрокардиографа с игольчатыми электродами,
- потребление кислорода и выделение углекислого газа автоматическим анализатором Spirolyt-2 (Германия).
2. Гематологические показатели:
- содержание гемоглобина в периферической крови крыс,
- количество эритроцитов,
- количество лейкоцитов,
- количество ретикулоцитов, одновременно и как показатель состояния костного мозга,
- формула крови.
3. Биохимические (исследования сыворотки крови) показатели:
- общий холестерин ферментным методом с использованием наборов реактивов Diocan,
- мочевина кинетическим уреазным методом с использованием набора реактивов Diocan,
- глюкоза глюкозооксидазным методом с использованием набора реактивов Diocan,
- содержание аланинаминотрансферазы в сыворотке крови кинетическим методом YFCC с использованием набора реактивов Diocan,
- содержание аспартатаминотрансферазы с использованием наборов реактивов Diocan,
- общий белок биуретовым методом с использованием набора реактивов Labsystems,
- креатинин.
В связи с трудностями получения необходимого количества сыворотки в одной серии экспериментов ряд показателей оценивался выборочно, но в сроки гипотетически максимального отклонения от контроля. Количественные величины показателей получены на биохимическом анализаторе BS300 Mindray (Китай) и гематологическом Hemolux (Китай).
4. Показатели клеточного звена иммунитета – величина процента фагоцитоза, фагоцитарное число, фагоцитарный индекс, количество Т-лимфоцитов, В-лимфоцитов, БОК.
5. Показатели аллергенной активности – РСАЛ, компрессная проба, лизис лейкоцитов.
6. Показатели мутагенной активности – количество аберраций и разрывов хромосом в культуре лейкоцитов человека, частота возникновения доминантных летальных мутаций в зародышевых клетках мышей, приводящих к гибели первое поколение на эмбриональной стадии развития, динамика выживаемости потомства.
7. Показатели эмбриотоксичности – количество жёлтых тел, количество мёртвых и живых эмбрионов, количество имплантантов, масса эмбрионов.
При исследовании мочи крыс определяли ее удельный вес. Мочу собирали в обменные клетки чешской фирмы Simax.
При патоморфологическом исследовании осуществлялась аутопсия с макроскопическим описанием, а также измерение относительной массы сердца, легких, печени, селезенки, почек, семенников, щитовидной железы и головного мозга.
В эксперименте осуществляли гистологическое исследование печени, щитовидной железы, легких, почек, желудка с окраской гематоксилин-эозином. В ряде случаев применены гистохимические методы с исследованием окислительно-восстановительных ферментов и других метаболитов.
Полученные данные обрабатывали статистически с помощью лицензионного программного комплекса «Статистика» и «Microsoft Offise Excel». Сравнение величин показателей в условиях подчинения закону нормального распределения производили с применением t-критерия Стьюдента. Отличия считались достоверными при Р≤0,05. В условиях исследования мутагенности оценивалась величина относительного риска [2].
Для установления величин острой токсичности препараты вводили в виде водного раствора (охлажденная кипяченая вода) через атравматичный металлический зонд в разных дозах крысам и мышам однократно. Для достижения больших доз препарат вводили в 2-3 приема на протяжении 6 часов. В необходимых случаях растворы препаратов вводились внутрибрюшинно, а для оценки раздражающего действия – наносились на выстриженный участок кожи и на конъюнктиву глаз. Ингаляционное воздействие осуществлялось в камерах в различных концентрациях аэрозолем дезинтеграции.
Для оценки кумулятивных свойств препараты вводились ежедневно. Период наблюдения составил 14 суток с регистрацией клиники отравления. Расчет среднесмертельных доз (по Керберу) осуществляли по динамике гибели.
Использование в экспериментах вышеприведенных методов исследования позволило установить характерные признаки острого, подострого и хронического отравления при пероральном, местном и ингаляционном поступлении исследуемых веществ в организм лабораторных животных. К существенным признакам отнесено повышение частоты сердечных сокращений, сохраняющееся и при снижении воздействующей дозы или концентрации 3-хлоратетилиндола. Обратила на себя внимание и достаточно высокая продолжительность гексеналового сна на фоне отчетливого повышения содержания печеночных ферментов в сыворотке крови и относительной массы печени. При этом установлен факт отсутствия мутагенного действия вещества, более того, выявлено его смягчающее действие на мутагенность ТиоТЭФ.
При ингаляционном воздействии в высоких концентрациях до минимального значения снижался в крови процент содержания Т-супрессоров. В экспериментах на морских свинках выявлено повышение величины показателя специфической агломерации лейкоцитов, а в периоде восстановления выявлен факт желудочковой экстрасистолии. Местного раздражающего действия на кожу не установлено. При этом характерные для 3-хлорацетилиндола признаки ответной реакции организма животных на воздействие в случае с 3-метиламинаацетилиндолом не проявились.
В результате проведённых исследований впервые получен обширный объём информации для использования в профилактической токсикологии и фармакологии данных химических соединений и им подобных из вновь синтезированных представителей класса индолов.
1. Vorob'ev, V.B. Fiziologiya gemostaza / V.B. Vorob'ev. - Moskva: Prof-Press, 2004. - 192s. - Tekst: neposredstvennyy.
2. Glanc, S. Mediko-biologicheskaya statistika (per. s angl.) / S. Glanc. -Moskva: Praktika, 1999. - 266 s.- Tekst: neposredstvennyy.
3. Guschina, A.A. Vozmozhnost' ispol'zovaniya nelineynyh krys dlya is-sledovaniya gemostaziologicheskih processov v usloviyah toksikologicheskogo eksperimenta / A.A. Guschina, G.G. Yushkov - Tekst: neposredstvennyy //Materialy nauchno-prakticheskoy konferencii, posvyaschennoy 25-letiyu sozdaniya sluzhby eksperimental'nogo biomedicinskogo modelirovaniya «Labora-tornye zhivotnye kak osnova eksperimental'noy mediciny» - 2009 - S.12-13.
4. Dolgov, V.V. Laboratornaya diagnostika narusheniy gemostaza / V.V. Dolgov, P.V. Svarin - Moskva: Triada, 2005. - 270s. - Tekst: neposredstven-nyy.
